1聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的基本原理
PCR反应过程与细胞内的DNA复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。PCR反应过程有以下3个步骤:①变性。将反应体系混合物加热到94 ℃,维持较短时间(大约15 s-30 s),使目标DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA作为反应模板。 ②退火。将反应体系冷却至特定的温度(引物的TM值左右或以下),引物与DNA模板的互补区结合,形成模板引物复合物。 ③延伸。将反应体系的温度提高到72 ℃并维持一段时间,引物在耐热聚合酶的作用下,以引物为固定起点,以4种单核苷酸(dNTP)作为底物合成新的DNA链。以上三步作为一个循环重复的进行,每一循环的产物作为下一循环的模板。如此循环数十次,从而使目的基因得到指数级扩增,达到检测或获取基因的目的。
2 PCR仪的分类
根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR,实时荧光定量PCR仪等几类。
2.1普通PCR仪
一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的,对目的基因退火温度的扩增。
主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。
2.2 梯度PCR仪
一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。真正的梯度,是每一排管都有精确的加热控温探头,2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。
梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。
2.3原位PCR仪
(有些品牌的PCR仪具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能,通过替换模块进行多用途开展实验工作)
是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA,还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。
2.4 实时荧光定量PCR仪(fluorescencer quantitive polymerase chain reaction, FQ