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革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒

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品牌: 尚宝生物
规格: 50T/100T
单价: 180.00元/瓶
起订: 1 瓶
供货总量: 999 瓶
发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
所在地: 上海
有效期至: 长期有效
最后更新: 2023-11-06 15:31
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公司基本资料信息
详细说明
                                  革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒

产品货号:26226

产品规格:50T/100T

产品组成:

试剂名称

50T

100T

RNase A

300μL

500μL

溶菌酶

3mL

5.5mL

溶液Ⅰ

15mL

30mL

溶液Ⅱ

15mL

30mL

溶液Ⅲ

20mL

40mL

漂洗液Ⅰ

24mL

48mL

漂洗液Ⅱ

15mL

15mL×2

洗脱液

15mL

30mL

吸附柱

50个

100个

收集管

50个

100个

注意:使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(将 试剂盒中提供的的RNaseA全部加入),混匀,置于2-8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

 

操作步骤:

1. 取1-5ml细菌培养物,12000rpm离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入200 μL溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA), 使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。再向其中加入50 μL溶菌酶,混匀。37℃水浴30min以上(根据菌液量可适当加长水浴时间)。注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。如不能确定为何种菌,请按阳性菌处理。

3. 向离心管中加入250 μL溶液Ⅱ,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:混匀一定要温和,以免污染基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要超过5min,以免质粒受到破坏。

4. 向离心管中加入350 μL溶液Ⅲ,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000 rpm离心10 min。注意:溶液Ⅲ加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

5. 将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),室温放置2min,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完,可分两次吸附) 。

6. 向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入700μL漂洗液Ⅱ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

8. 向吸附柱中加入500μL漂洗液Ⅱ,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

9. 12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

10. 将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50-200μL经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置 2min,12000rpm离心1min。

11. (可选)为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心 1min。

 

注意事项:

1. 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。

2. 洗脱缓冲液体积不应少于50uL,体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围) ,pH值低于7.0会降低洗脱效率。 DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。

3. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用5-10ml过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。

4. DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9 ,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。

 

保存条件

RNA酶,溶菌酶于-20℃保存,其它试剂室温保存。复检期一年。

 

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